Arna chur in eagar ag Peter Sarnow, Scoil an Leighis Ollscoil Stanford, Ollscoil Stanford, California, ceadaithe an 25 Nollaig, 2020 (athbhreithnithe an 25 Deireadh Fómhair, 2020)
Tuairiscímid an t-idirghníomhú idir fo-aonaid i macasamhlú coimpléisc coróinvíreas-trascríobh, atá riachtanach le haghaidh macasamhlú agus caomhnú éabhlóideach.Chuireamar fianaise ar fáil go bhfuil gníomhaíocht aistrithe nucleoside monophosphate (NMP) i dtras-aistrithe ag fearann NiRAN a bhaineann le nsp12, agus aithníodh nsp9 (próitéin ceangailteach le RNA) mar a sprioc.Déanann NiRAN catalú ar cheangal comhfhiúsach an ghluaiseacht NMP leis an bhfoirceann aimín nsp9 caomhnaithe in imoibriú a bhraitheann ar iain Mn2+ agus ar iarmhair Asn caomhnaithe in aice láimhe.Fuarthas amach go bhfuil gníomhaíocht NiRAN agus nsp9 NMPylation riachtanach le haghaidh macasamhlú an choróinvíris.Ligeann na sonraí dúinn an ghníomhaíocht seo den mharcóir einsím víreas neadaithe a nascadh leis na breathnuithe roimhe seo sa hipitéis go bhfuil tionscnamh sintéise RNA i rang de víris RNA comhsheasmhach go feidhmiúil agus go héabhlóideach.
Tá an RNA-chleithiúnach RNA polymerase (RdRps) de Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, agus 12 teaghlach eile) nasctha leis an bhfearann aimín-críochfort (N-críochfort) sa phróitéin neamhstruchtúrtha (nsp) a scaoiltear ón polapróitéin, ar a dtugtar NiRAN. Tá 1ab comhdhéanta de phríomhprótease víreasach (Mpro).Roimhe seo, tuairiscíodh gníomhaíocht GMPylation/UMPylation féin an víreas artaireach NiRAN-RdRp nsp féin, agus moladh díomuan a ghiniúint chun monafosfáit núicléaside (NMP) a aistriú chuig an víreas (neamhaithnid faoi láthair) agus/nó bithpholaiméiriú cille Rudaí.Anseo, léirímid go bhfuil gníomhaíocht NMPylation Mn2+-spleách ag an choróinvíreas (Coróinvíreas Daonna [HCoV]-229E agus Coronafeiríteas Géar-Ghéar-Idirghabhála 2) nsp12 (NiRAN-RdRp), a dhíorthaítear ó nsp9 trí fhoirmiú Mpro-mediated nsp9 Tar éis. scaoiltear an nsps cliathánach N-críochfort go próitéalaíoch, nasctar an fosfaramide leis an aimín príomhúil (N3825) ag an gcríochfort N de nsp9.Is é triphosphate uridine an núicléitíd is fearr san imoibriú seo, ach is comhfhoshraitheanna oiriúnacha iad triphosphate adenosine, guanosine triphosphate, agus cytidine triphosphate.Chinn staidéir ar shóchán ag baint úsáide as próitéiní athchuingreach den choróinvíreas nsp9 agus nsp12 agus mutants HCoV-229E a ndearnadh innealtóireacht ghéiniteach orthu na hiarmhair a bhí riachtanach le haghaidh NMPylation nsp9 arna idirghabháil ag NiRAN agus macasamhlú víreas i gcultúr na gceall.Dheimhnigh na sonraí tuar iarmhair láithreán gníomhach NiRAN agus chinn siad ról tábhachtach iarmhair nsp9 N3826 in nsp9 NMPylation agus macasamhlú víreas in vitro.Tá an t-iarmhar seo ina chuid den seicheamh trípeiptíde NNE NNE caomhnaithe agus cruthaíodh gurb é an t-aon iarmhar athróg de nsp9 agus a homalogs sa teaghlach coróinvíreas.Soláthraíonn an staidéar seo bonn láidir don staidéar feidhmiúil ar ghníomhaíocht NMPylation de víris neadaithe eile agus molann sé spriocanna féideartha d’fhorbairt drugaí frithvíreasacha.
Nidovirales dearfach-snáithe RNA víreas infects éagsúla veirteabraigh agus inveirteabraigh (1, 2).Áirítear leis an ordú faoi láthair 14 teaghlach (3), a bhfuil staidéar forleathan déanta ar theaghlach an choróinvíris le 20 bliain anuas.Ag an am sin, tháinig trí choróinvíreas zónóiseach chun cinn ó óstach ainmhithe agus ba chúis le ráigeanna ar scála mór d’ionfhabhtuithe riospráide tromchúiseacha i ndaoine.Lena n-áirítear paindéimí leanúnacha de bharr galair thógálacha géara tromchúiseacha.Coronavirus Siondróm Riospráide 2 (SARS-CoV-2) (4ââ7).Comheagraíocht ghéanóim atá i gceist le Nidoviruses, agus tá fo-aonad an choimpléasc macasamhlú-trascríobh-ceangailte (RTC) faoi cheangal membrane ionchódaithe sa chríochfort 5-²-dhá thrian agus i bpríomhfho-aonad struchtúrach an cháithnín víreas, chomh maith le roinnt gabhálais. .Próitéin, atá ionchódaithe sa tríú foirceann 3??² den ghéanóm (1).Seachas i gcás teaghlach amháin de víris phlánacha (Monoviridae) (8), ionchódaíonn gach víreas neadaithe fo-aonaid RTC in dhá fhráma léitheoireachta mór oscailte (ORF) ORF1a agus ORF1b, a aistrítear ó RNA genomic de.Ionchódaíonn ORF1a polapróitéin (pp) 1a, agus ionchódaíonn ORF1a agus ORF1b pp1ab i gcomhpháirt.Le rannpháirtíocht ghinearálta an phríomh-protease (Mpro) ionchódaithe ag ORF1a, déantar pp1a agus pp1ab a phróiseáil go próitéalaíoch i réimse próitéiní neamhstruchtúracha (nsps), ar a dtugtar 3CLpro freisin, toisc go bhfuil homology aige le 3Cpro an picornavirus ( 9).Ceaptar go gcuirtear na nsps seo le chéile i RTC mór dinimiciúil, go gcatalaíonn siad sintéis RNA genomic (macasamhlú) agus sraith RNA subgenomic (trascríobh), agus úsáidtear iad chun léiriú an ORF atá suite le sruth ó ORF1b (10 ? ? ?12).
Áirítear sa chroí-RTC polaiméaráise RNA-spleách RNA (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) agus roinnt einsímí próiseála RNA, atá ionchódaithe go príomha i ORF1b agus sa teaghlach coronavirus Tá nsp12-nsp16 agus nsp9-nsp12 sa teaghlach Arterioviridae (féach tagairt 10â 12).Léiríonn RdRp agus HEL1 dhá fhearann (an cúigiú cuid) de víreas nead an éin agus tá homaleolaíocht acu i measc víris RNA eile.Creidtear go gcabhraíonn fo-aonaid eile le macasamhail lárnach, lena n-áirítear roinnt nsps beaga a scaoiltear ón réigiún carbox-teirminéal (C-críochfort) de pp1a, le sruth ó Mpro (coronavirus nsp5 agus víreas artaireach nsp4, faoi seach).Tá cosaint teaghlach-shonrach teoranta acu agus gníomhaíochtaí éagsúla (a ndéantar athbhreithniú orthu i dtagairt 10ââ12).
Le déanaí, fuarthas fearann le tréithe uathúla móitífeanna seicheamh ag an bhfoirceann aimín (N-críochfort) in aice le RdRp i ngach víreas neadaithe, ach gan aon víris RNA eile (16).Bunaithe ar a shuíomh agus ar ghníomhaíocht nucleotide transferase (nucleoside monophosphate [NMP] transferase), tá an fearann seo ainmnithe NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).Is ionann an teaglaim dé-fearainn de NiRAN-RdRp agus nsp12 sa teaghlach Coronaviridae agus nsp9 sa teaghlach Arterioviridae, agus i nestoviridae eile, táthar ag súil go scaoilfear NiRAN-RdRp mar nsp neamhspleách ón polapróitéin víreasach.Sa choróinvíreas, tá ??1/450 iarmhair i bhfearann NiRAN agus tá sé ceangailte leis an bhfearann C-críochfort RdRp tríd an réigiún nascóirí (16?19).I Víreas Arteritis Eachaí (EAV) (Arteriviridae), léiríonn nsp9 athchuingreach Mn2+ gníomhaíochtaí UMPylation agus GMPylation ian-spleách (féin), atá ag brath ar thrí bhonn seicheamh caomhnaithe i nestovirus, AN, BN agus CN Na hiarmhair sa seicheamh.An áit a seasann N do NiRAN) (16).Is móitíf preAN nach bhfuil chomh coimeádach céanna cliathánach N-críochfort na móitífeanna seo.Tá cuid de na hiarmhair a chaomhnú freisin i kinases próitéin a bhaineann i bhfad i gcéin, áit a bhfuil sé léirithe a bheith páirteach i nucleoside triphosphate (NTP) ceangailteach agus catalaíoch gníomhaíochta (20, 21).I gcomhréir leis an bhreathnóireacht seo, is féidir roinnt príomh-iarmhair láithreáin gníomhacha sa pseudokinase SelO ó Pseudomonas syringae a chur le chéile leis an sárchoimpléasc SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 a foilsíodh le déanaí.Iarmhair NiRAN Coronavirus caomhnaithe forshuite sa mhicreastruchtúr leictreoin.Próitéin athchuingreach (17).Tá sé speculated go mbeidh an doiciméadaithe (féin) U/GMPylation tháirgeadh staid dhíomuan chun NMP a aistriú chuig an tsubstráit (nach bhfuil aithne faoi láthair) (16), agus an cosúlacht struchtúrach idir NiRAN agus próitéin kinase (17, 19) ) An bhfuil an hipitéis go Athraíonn NiRAN próitéiní eile.
Déanann go leor gnéithe, lena n-áirítear a nasc córasach uathúil agus uathúil le víris neadaithe agus scaradh géiniteach ó RdRp, NiRAN mar eochair-einsím rialála réasúnta do víris neadaithe, rud atá ríthábhachtach dá dteacht chun cinn agus dá bhféiniúlacht.Roimhe seo, glaodh ar thrí fheidhm fhéideartha a bhain le NiRAN chun aistriúchán géanóm/foghinomaíoch nó macasamhlú/trascríobh a rialú.Agus na sonraí tearca agus neamhiomlána atá ar fáil ag an am á mbreithniú, tá buntáistí agus míbhuntáistí ag gach feidhm (16).Sa taighde seo, tá sé mar aidhm againn staidéir bhithcheimiceacha agus droim ar ais géiniteacha an choróinvíris a ionadaíonn an dá ghéine a chomhcheangal, agus ár dtorthaí a chur i gcúlra éabhlóideach sóchán nádúrtha an teaghlaigh choróinvíris, chun léargas a fháil ar an réimse mistéireach seo.Tuairiscímid dul chun cinn mór i dtuiscint NiRAN trí spriocanna nádúrtha a aithint i RTC, a chuireann (i measc na dtrí hipitéis atá ar fáil) le ról an fhearainn seo maidir le sintéis RNA víreas neadaithe a thionscnamh.Osclaíonn an taighde seo féidearthachtaí freisin do róil eile de chuid NiRAN ar an gcomhéadan óstach víreas.
Chun airíonna einsímeacha an fhearainn NiRAN a bhaineann leis an víreas corónach nsp12 a shainiú, chuireamar foirm athchuingreach de choróinvíreas daonna 229E (HCoV-229E) nsp12 in E. coli ar fáil, le clib His6 ag an gcríochfort C, agus chomhcheangaileamar an próitéin le [α32-P ] Gor mar aon le NTP i láthair MnCl2 mar a thuairiscítear in Ábhair agus Modhanna.Léirigh an anailís ar an táirge imoibrithe láithreacht próitéin raidió-lipéadaithe ag comh-imirce le nsp12 (106 kDa), rud a thugann le fios go gcatalaíonn an coronavirus nsp12 foirmiú adductáin próitéine-NMP comhfhiúsacha, arna bhfoirmiú go fabhrach le monafosfáit fualáin (UMP) (Fíor 1A) Agus B).Léirigh anailís chainníochtúil, i gcomparáid le núicléatídí eile, gur tháinig méadú 2 go 3 huaire ar dhéine comhartha ionchorprú UMP (Fíor 1C).Tá na sonraí seo comhsheasmhach leis an ngníomhaíocht aistrithe NMP tuartha d’fhearann NiRAN den choróinvíreas (16), ach léiríonn sé go bhfuil roghanna núicléitíde fearainn NiRAN den choróinvíreas agus an víreas artaireach difriúil.
Gníomhaíocht féin-NMPylation de HCoV-229E nsp12.(A) Cuireadh HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) leis an NTP ainmnithe [α-32P] i láthair 6 mM MnCl2 ar feadh 30 nóiméad (féach Ábhair agus Modhanna le haghaidh sonraí).Scaradh na táirgí imoibrithe le SDS-PAGE agus dhaite le Coomassie gorm iontach.(B) Léirítear an phróitéin radailipéadaithe trí íomháú fosfair.Taispeántar seasaimh nsp12-His6 agus marcóirí mais mhóilíneacha próitéin (i gcilidaltons) in A agus B. (C) Cinneadh déine an chomhartha radaighníomhach (meán ± SEM) ó thrí thurgnaimh neamhspleácha.*P≤0.05.Tá an neart comhartha (céatadán) bainteach le UTP.
Cé gur léiríodh go bhfuil gníomhaíochtaí einsíme a bhaineann le NiRAN riachtanach chun EAV agus SARS-CoV a mhacasamhlú i gcultúr na gceall (16), níl feidhm shonrach NiRAN agus spriocanna féideartha socraithe fós.Spreag an chosúlacht struchtúrach a tuairiscíodh le déanaí idir NiRAN agus teaghlach de phróitéiní le fillteacha próitéine kinase-mhaith (17, 22) sinn chun an hipitéis a thástáil go gcatalaíonn NiRAN NMPylation próitéiní eile.Ghineamar sraith de spriocanna homalógacha féideartha, lena n-áirítear próitéiní neamh-struchtúracha ionchódaithe ag HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), gach ceann acu ina bhfuil clib C-críochfort His6 (aguisín IR, Tábla S1), Agus gor na próitéiní seo le [α32-P] trífhosfáit fualáin ([α32-P]UTP) i láthair nó in éagmais nsp12.Sheirbheáil albaimin serum bó agus próitéin comhleá MBP-LacZα a tháirgtear in E. coli mar rialuithe (Fíor 2A, lánaí 1 go 7).Rinneadh anailís ar an próitéin raidió-lipéadaithe ag leictreafóiréis glóthach dodecyl sulfate-polyacrylamide sóidiam (SDS-PAGE) agus uathradagrafaíocht, agus fuarthas amach go raibh comhartha láidir radaighníomhach san imoibriú ina raibh nsp12 agus nsp9.Freagraíonn suíomh an chomhartha do mhais mhóilíneach nsp9, rud a léiríonn UMPylation nsp12-mediated de nsp9 (Fíor 2B, rian 7).Ní bhfuarthas UMPylated ar phróitéin tástála ar bith eile, rud a thug orainn an tátal a bhaint as gur substráit ar leith de nsp12 é nsp9.Ag teacht leis na sonraí féin-NMPylation a thaispeántar i bhFíor 1, tá nsp12 in ann na ceithre NMP go léir a aistriú go nsp9, cé go bhfuil an éifeachtúlacht difriúil, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP)) ( Pictiúr).3 A agus B).Faoi na coinníollacha a úsáidtear sa mheasúnacht seo (giorrú an imoibrithe agus an t-am nochta, laghdú ar an tiúchan de nsp12; ábhair agus modhanna), níorbh fhéidir an féin-NMPylation de nsp12 a bhrath (i gcomparáid Fíor 2B, lána 7, agus Fíor 1B), a bhí UMP éifeachtach (Agus babhtaí iolracha) aistrithe ó nsp12 go nsp9.Éilíonn gníomhaíocht UMP transferase láithreacht iain Mn2+, mar a léirítear i bhFíor 3C, cé nár breathnaíodh ach gníomhaíocht aistrithe UMP íosta i láthair Mg2+, agus níor breathnaíodh aon ghníomhaíocht i láthair an dá chaidiún divalentacha eile a tástáladh.Fuarthas sonraí comhchosúla i dtástálacha NMPylation ina raibh triphosphate cítínín (CTP), trífhosfáit guanóisín (GTP), agus trífhosfáit adenosine (ATP) (aguisín IR, Fíor S1).
HCoV-229E nsp12-mediated UMPylation de nsp9.Baineadh úsáid as sraith foshraitheanna próitéine (lena n-áirítear albaimin séiream buaibheach, MBP-lacZα, agus sraith nsps HCoV-229E lipéadaithe le C-terminal His6 ionchódaithe ag ORF1a) chun gníomhaíocht UMPylation HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated a mheas. próitéin.Gor an próitéin le [α-32P] UTP ar feadh 10 nóiméad in éagmais (A) nó láithreacht (B) nsp12 mar a thuairiscítear sna hábhair agus sna modhanna.Ag barr A agus B, taispeántar glóthach SDS-polyacrylamide dhaite le Coomassie Brilliant Blue, agus ag bun A agus B, taispeántar na autoradiograms comhfhreagracha.Tugtar suíomh marcóir mais mhóilíneach próitéin (i kilodaltons) ar thaobh na láimhe clé.Léirítear freisin suíomh nsp12-His6 (B, barr) agus an comhartha radaighníomhach a breathnaíodh le linn gor nsp12-His6 le nsp9-His6 (B, lána 7), rud a léiríonn go [α-32P]UMP go nsp9-His6 (12.9 kDa), nár breathnaíodh i gcás próitéiní eile a tástáladh.
HCoV-229E tréithriú bithcheimiceach agus víreolaíoch nsp9 NMPylation trí mheán NiRAN.(A agus B) Ról an chomhfhoshraith núicléitíde a úsáidtear san imoibriú.Déantar Nsp12-His6 agus nsp9-His6 a mheascadh agus a ghoradh i láthair NTPanna [α-32P] éagsúla sa mheasúnacht chaighdeánach NMPylation.(A, barr) Coomassie-dhaite nsp9-His6 scartha le SDS-PAGE.(A, bun) Autoradiograph den limistéar céanna den fhoirmiú.(B) Déantar an ghníomhaíocht choibhneasta (meán ± SEM) i láthair an chofactor nucleotide ainmnithe a chinneadh ó thrí thurgnaimh neamhspleácha.*P≤0.05.(C) Ról na n-ian miotail.Taispeántar an tástáil chaighdeánach NMPylation i láthair [α-32P] UTP agus iain mhiotail éagsúla, gach ceann acu le tiúchan 1 mM.I C, tá an barr, Coomassie dhaite nsp9-His6 léirithe, agus i C, an bun, taispeántar an autoradiography comhfhreagrach.Taispeántar méid na próitéine lipéadaithe (i gcilidaltóin) ar chlé A agus C. (D) Tá an fhoirm shóiteáin de HCoV-229E nsp12-His6 a iompraíonn an t-ionadú aimínaigéad sonraithe in [α-32P]UTP, mar a thuairiscítear in Ábhair agus Modhanna.Déantar an nsp9-His6 raidió-lipéadaithe a tháirgtear san imoibriú NMPylation a bhrath trí íomháú fosfarylation (D, barr).Taispeántar an ghníomhaíocht choibhneasta i gcomparáid leis an gcineál próitéine fiáin (wt) in D, agus glactar leis an mbun mar an meán (±SEM) ó thrí thurgnamh Neamhspleách.Léiríonn réiltíní ionadú na n-iarmhar neamhchaomhnaithe.(E) Rinneadh an titer víreas i gcultúr na gcealla p1 ollnóva a fuarthas 24 uair tar éis an ionfhabhtaithe a chinneadh trí mheasúnú plaic.Léirítear na hionadaithe codon i bhfearann NiRAN den tsóiteán HCoV-229E a ndearnadh innealtóireacht air (bunaítear uimhriú na n-iarmhar ar a suíomh i pp1ab).Baineadh úsáid as an tsóiteán RdRp suíomh gníomhach atá easnamhach ó thaobh macasamhlú de nsp12_DD4823/4AA mar rialú.
D'fhonn tuiscint níos doimhne a fháil ar shuíomh gníomhach NiRAN agus na hiarmhair a bhaineann le gníomhaíocht transferase NMP a bhaineann go sonrach le nsp9 a chinneadh, rinneamar anailís sócháin, inar chuireamar ionad na n-iarmhar coimeádach i móitífeanna NiRAN AN, BN agus CN ( 16) Ala atá ann (aguisín IR, Fíor S2).Ina theannta sin, rinneadh meastóireacht ar thionchar ionadaí coimeádach Arg-to-Lys nó Lys-to-Arg in dhá chás.Mar rialú (diúltach), cuirtear Ala in ionad iarmhair nach bhfuil caomhnaithe nó níos lú i bhfearann NiRAN de coronaviruses agus víris neadaithe eile. Laghdaíonn BN) agus D4280A (CN) go suntasach nó fiú deireadh a chur le nsp9 NMPylation trí nsp12, agus coimeádann próitéiní le hionadaigh coimeádach (R4178K), K4116R 60% agus 80% dá ngníomhaíocht, rud a léiríonn go bhfuil maolú ar na srianta ar a taobh faoi seach. slabhraí íogair ó thaobh fisiceimiceach de (Fíor 3D).Tá sé i bhfad níos lú díobhálach a chur in ionad roinnt iarmhar caomhnaithe eile E4145A, D4273A, F4281A agus D4283A, agus níl ach laghdú measartha ar nsp9 UMPylation.Fuarthas torthaí comhchosúla in imoibrithe NMPylation nsp9 a bhaineann le NTPanna eile (Fíor 3D agus aguisín SI, Fíor S3), ag dearbhú go bhfuil na héifeachtaí breathnaithe ar ionaid aimínaigéad ar leith neamhspleách ar an gcineál comh-fhoshraith núicléitíde a úsáidtear.Ansin, rinneamar tástáil ar an tionchar a d’fhéadfadh a bheith ag na hionadaithe nsp12 seo ar mhacasamhlú coróinvíreas i gcultúr na gceall.Chuige sin, d’úsáideamar teimpléid chomhlántacha DNA (cDNA) oiriúnacha a ndearnadh innealtóireacht ghéiniteach orthu, clónáilte i víreas athchuingreach vaccinia (23, 24) chun 5 -7 ceall a thrascríobh.Léirigh toirtmheascadh ar shliocht víreas ionfhabhtaíoch a táirgeadh sna cealla seo nach raibh formhór na mutants NiRAN HCoV-229E indéanta (Fíor 3E).Áirítear le grúpa mutants víreasach neamh-inmharthana roghanna eile a léiríodh chun gníomhaíocht NMP transferase in vitro a dhíchur nó a laghdú go suntasach (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ach tá dhá rogha eile ann (K4116R, E4145A) 8 % in áirithe?Tugann a ngníomhaíocht NMPylation in vitro le fios go bhfuil srianta breise i gceist.Ar an gcaoi chéanna, tháirg dhá shóchán eile (R4178K, F4281A) a d'eascair laghdú measartha ar ghníomhaíocht NMPylation in vitro NiRAN víris beo, áfach, laghdaigh na víris seo titers go suntasach trí mhacasamhlú.Ag teacht leis na sonraí gníomhaíochta in vitro a léirítear i bhFíor 3D, nuair a chuirtear in ionad ceithre iarmhair eile nach bhfuil caomhnaithe sa choróinvíreas agus/nó i víris neadaithe eile (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) tháirg víris inmharthana an sliocht, in ainneoin go raibh titer measartha laghdaithe i gcomparáid leis an víreas cineál fiáin (Fíor 3E).
D'fhonn staidéar a dhéanamh an bhfuil gníomhaíocht aistrithe NMP trí mheán NiRAN ag brath ar an bhfearann gníomhach RdRp, cuireadh Ala in ionad an dá iarmhair Asp caomhnaithe a bhaineann le comhordú na n-ian miotail défhiúsacha (11) i móitíf RdRp C. Coinníonn an próitéin a eascraíonn as nsp12_DD4823/4AA a ghníomhaíocht NMPylation nsp9, rud a thugann le fios nach dteastaíonn gníomhaíocht polaiméaráis le gníomhaíocht nsp12-mediated in vitro nsp9 NMPylation (Aguisín IR, Fíor S4).
Tar éis dúinn an ghníomhaíocht aistrithe NMP a bhaineann go sonrach le nsp9 a bhunú le haghaidh nsp12, rinneamar iarracht an adduct NMP-nsp9 a shainiú de réir mais-speictriméadrachta (MS).Thaispeáin an mais-speictream iomlán próitéine de HCoV-229E nsp9 athchuingreach buaic ag 12,045 Da (Fíor 4A).Níor athraíodh cáilíocht nsp9 nuair a cuireadh nsp12 leis, rud a thugann le fios nach gcruthódh nsp12 agus nsp9 coimpléasc cobhsaí faoi na coinníollacha a úsáideadh (dínádúrú) (Fíor 4A).I láthair UTP agus GTP, léirigh mais-thomhas an imoibrithe ina bhfuil nsp9 agus nsp12 faoi seach gur bhog mais próitéine UTP 306 Da, agus bhog mais próitéin GTP 345 Da, rud a léiríonn go gceanglaíonn gach móilín nsp9 UMP nó GMP. (Pictiúr 4) C agus D).Tá sé tuairimithe go dtagann an fuinneamh atá ag teastáil le haghaidh nsp9 NMPylation trí mheán NiRAN ó hidrealú NTP agus scaoileadh pireafhosfáit.Cé gur úsáideadh farasbarr molar 10-huaire de nsp9 (sprioc) ná nsp12 (einsím) san imoibriú seo, breathnaíodh NMPylation beagnach iomlán de nsp9, rud a léiríonn go bhfuil an idirghníomhaíocht idir nsp12 agus nsp9 gearr-chónaí, agus is féidir le nsp12 NMPylate níos mó nsp9. móilín in vitro.
NMPylation singil nsp9 i láthair nsp12 agus UTP nó GTP.Taispeántar mais-speictream iomlán díconvoluted próitéine HCoV-229E nsp9 (aguisín IR, Tábla S1) (AD).(A) nsp9 ina n-aonar, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 i láthair UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 i láthair GTP.
Chun na hiarmhair nsp9 UMPylated ag nsp12 a chinneadh, scoiltíodh nsp9-UMP le trypsin.Scaradh na peiptídí a d'eascair as sin le crómatagrafaíocht leacht nana-ardfheidhmíochta (HPLC) agus rinneadh anailís orthu de réir mais-speictriméadrachta comhuaineach (MS/MS) ar líne.Léirigh anailís sonraí ag baint úsáide as pacáiste bogearraí Byonic (Protein Metrics) UMPylation an aimínaigéad N-críochfort.Deimhnítear é seo de láimh.Léirigh mais-speictream na peiptíde réamhtheachtaithe [UMP]NNEIMPGK (aguisín SI, Fíor S5A) blúire ag 421 m/z, rud a thugann le fios go gceanglaíonn UMP le hiarmhar 1 de nsp9.
Ag críochfort N nsp9, caomhnaítear Asn i measc chomhaltaí Orthocoronavirinae (aguisín IR, Fíor S6).Cé go gcreidimid gurb é an nítrigin aimín príomhúil N-críochfort an glacadóir is dóichí do UMP, shocraigh muid fianaise bhreise a fháil ar cheangal NMP ag an gcríochfort N.Ar an gcúis seo, díorthaíodh an peptide N-críochfort NMPylated agus NMPylated nsp9 íonaithe ag HPLC i láthair aicéatón agus cianabróhidríd sóidiam.Faoi na coinníollacha seo, ní féidir ach amines bunscoile saor in aisce a mhodhnú le próipil (25).Tá dhá phríomhaimín sa pheptíde N-críochfort a dhíorthaítear nsp9 leis an seicheamh NNEIMPGK, ceann ag críochfort N Asn agus an ceann eile ag taobhshlabhra Lys ag an gcríochfort C.Dá bhrí sin, is féidir grúpaí próipile a thabhairt isteach ag an dá cheann.Taispeántar na crómatogramanna ian eastósctha de pheptídí neamh-NMPylated san aguisín SI, Fíor S5B.De réir mar a bheifí ag súil leis, is féidir peiptídí N-críochfort agus C-críochfort (mona)propilated (aguisín IR, Fíor S5B, lána uachtarach) agus peptides díphróipilithe (aguisín IR, Fíor S5B, lána íochtair) a aithint.Athraíonn an patrún seo le húsáid an pheptíde N-críochfort NMPylated de nsp9.Sa chás seo, ní féidir ach peptídí próipileáilte C-críochfort a aithint, ach ní aithnítear peptídí próipilithe N-críochfort agus peptídí díphróipilithe (Aguisín IR, Fíor S5C), rud a léiríonn go bhfuil UMP aistrithe chuig an amine bunscoile N-críochfort Chun é seo a chosc. grúpa ó athruithe a dhéanamh.
Ansin, cuirimid Ala nó Ser in ionad (le Ala nó Ser) nó scriosaimid na hiarmhair chaomhnaithe ag an gcríochfort N de nsp9 chun srianta a bhaineann go sonrach le sprioc a shainiú.Bunaithe ar ár sonraí MS a léiríonn go ndéanann NiRAN adduct nsp9-NMP le príomh-aimín an iarmhair N-críochfort nsp9, rinneamar hipitéisiú go n-éilíonn nsp9 NMPylation an máistir protease víreasach (Mpro, nsp5) chun an críochfort nsp9 N a scaoileadh ó a réamhtheachtaí polapróitéin.Chun an hipitéis seo a thástáil, rinneamar próitéin réamhtheachtaithe nsp7-11 ina raibh nsp9 in E. coli agus rinneamar tástáil chaighdeánach NMPylation i láthair [α-32P] UTP (ábhair agus modhanna).Mar a léirítear i bhFíor 5A (lána 3), níl an réamhtheachtaí nsp7-11 neamhghearrtha lipéadaithe le nsp12.I gcodarsnacht leis sin, má scoilteann nsp5 athchuingreach nsp7-11 chun nsp9 (agus nsps eile) a scaoileadh ón réamhtheachtaí, aimsítear próitéin radailipéadaithe a aistríonn le nsp9, rud a dhearbhaíonn ár gconclúid go bhfuil NiRAN agus N- Foirmiú roghnaíoch ar asbhaintí comhfhiúsacha nsp9-NMP .Aimín príomhúil teirminéil an N-teirminéal Asn (suíomh 3825 in pp1a/pp1ab).Tacaítear leis an gconclúid seo freisin trí thurgnaimh a úsáideann an tógáil nsp9, ina bhfuil iarmhair bhreise nó dhó ag an gcríochfort N.Sa dá chás, cuireadh deireadh le UMPylation nsp9 arna idirghabháil ag NiRAN (Aguisín IR, Fíor S7).Ansin, rinneamar próitéin a tháirgeadh le ceann amháin nó dhá iarmhar Asn a scriosadh as an seicheamh peptide 3825-NNEIMPK-3832 ag críochfort N-nsp9.Sa dá chás, cuireadh bac iomlán ar UMPylation nsp9 (Fíor 5B), ag soláthar fianaise bhreise go bhfeidhmíonn an fíor-nsp9 N-terminus mar receptor NMP.
Próiseáil próitéalaíocha nsp9 agus ról iarmhair N-críochfort in UMPylation trí mheán nsp12.(A) Tá críochfort nsp9 N saor in aisce ag teastáil ó UMPylation nsp9.Tá Nsp7-11-His6 réamh-ghor ag 30 °C i maolán braite NMPylation ina bhfuil UTP i láthair nó in éagmais Mpro athchuingreach (nsp5-His6).Tar éis 3 uair an chloig, cuir tús leis an measúnacht NMPylation trí nsp12-His6 a chur leis mar a thuairiscítear in Ábhair agus Modhanna.Baineadh úsáid as an imoibriú ina bhfuil nsp5-His6 (lána 1) agus nsp9-His6 (lána 2) mar rialú.Tar éis 10 nóiméad, cuireadh deireadh leis an imoibriú agus scartha an meascán imoibriúcháin le SDS-PAGE.Bhí an próitéin dhaite le Coomassie Brilliant Blue (A, barr).Taispeántar ar dheis an réamhtheachtaithe Nsp7-11-His6 agus an táirge próiseáilte a eascraíonn as scoilteacht idirghabhála nsp5-His6.Tabhair faoi deara le do thoil (mar gheall ar a mbeagmhéid) nach bhfuil nsp7 agus nsp11-His6 inbhraite sa fhoirmiú seo, agus déantar an t-imoibriú a fhorlíonadh le nsp5-His6 (lánaí 1 agus 4; léirítear suíomh nsp5-His6 le ciorcal soladach) nó nsp9-His6 (Lána 2) ina bhfuil méid beag MBP (arna léiriú ag ciorcail oscailte) mar neamhíonachtaí iarmharacha toisc go gcuirtear in iúl iad mar phróitéiní comhleá MBP (aguisín IR, Tábla S1).(B) Níl iarmhar Asn amháin nó dhó sa leagan Nsp9-His6 (uimhreacha iarmhair de réir an tsuímh i pp1a/pp1ab) agus déantar é a íonú agus a ghoradh le nsp12-His6 agus [α-32P] UTP.Taispeántar B, SDS-PAGE dhaite le Coomassie ag an mbarr, B, taispeántar an autoradiograph comhfhreagrach ag bun.Taispeántar suíomh an marcóra meáchain mhóilíneach (i kilodaltons) ar chlé.(C) Cuireadh Ala nó Ser in ionad iarmhair chaomhnaithe HCoV-229E nsp9-His6 N-críochfort, agus úsáideadh an méid céanna próitéine san imoibriú UMPylation idirghabhála nsp12-His6.Scaradh na táirgí imoibriúcháin le SDS-PAGE agus dhaite le Coomassie Brilliant Blue (C, barr), agus braitheadh íomháú phosphorescence (C, lár) le radiolabeled nsp9-His6.Ag baint úsáide as próitéin de chineál fiáin (wt) mar thagairt (a leagtar go 100%), ríomhadh an ghníomhaíocht NMPylation coibhneasta (meán ± SEM) ó thrí thurgnaimh neamhspleácha.(D) Cinneadh titers víreas i gcultúr cille p1 supernatant de chealla Huh-7 ionfhabhtaithe le HCoV-229E de chineál fiáin cealla Huh-7, agus mutants a iompraíonn ionaid aimínaigéad ainmnithe i nsp9 trí mheasúnú plaic.Baineadh úsáid as an móitíf RdRp C dúbailte tsóiteáin DD4823/4AA easnamhach mar rialú diúltach.
Tá críochfort N nsp9 (go háirithe poist 1, 2, 3, agus 6) an-chaomhnaithe i measc bhaill fhotheaghlach Orthocoronavirinae (aguisín IR, Fíor S6).Chun staidéar a dhéanamh ar ról féideartha na n-iarmhar seo in nsp12-mediated nsp9 NMPylation, cuireadh Ala nó Ser (ina aonar nó i dteannta a chéile) in ionad dhá iarmhair Asn as a chéile ag críochfort N nsp9.I gcomparáid le cineál fiáin nsp9, tháinig laghdú níos mó ná dhá uair ar UMPylation nsp12-mediated (Fíor 5C) nuair a cuireadh Ala nó Ser in ionad N3825.Ag teacht lenár gconclúid go dtarlaíonn NMPylation ag an aimín príomhúil N-críochfort in ionad an tslabhra taobh den iarmhair N-críochfort, thugamar faoi deara NMPylation iarmharach suntasach le hathsholáthar N3825A agus N3825S.Suimiúil go leor, má chuirtear Ala nó Ser in ionad an dara Asn, laghdaítear UMPylation nsp9 níos láidre (níos mó ná 10 n-uaire), agus níl ach tionchar measartha ag athsholáthar Ala ag poist 3, 4, agus 6 ar UMPylation nsp9 (Fíor 2). ).5C).Fuarthas torthaí comhchosúla ag baint úsáide as ATP, CTP nó GTP (aguisín IR, Fíor S8).I dteannta a chéile, léiríonn na sonraí seo príomhról N2826 (suíomh 2 in nsp9) in nsp9 NMPylation.
D’fhonn fianaise bhreise a fháil ar an gcomhghaol feidhme idir críochfort N nsp9 agus NMPylation, rinneamar ailíniú seicheamh iolrach (MSA) den seicheamh nsp9 den teaghlach Coronavirus (ag éagsúlacht idir 104 agus 113 iarmhair) (Aguisín IR, Fíor S6).Ar an iomlán, i 47 speiceas (aitheanta agus tuartha) de 5 ghéine den fhotheaghlach Orthocoronavirinae a ionfhabhtaíonn mamaigh éagsúla, éin agus óstaigh reiptín, ní bhfuarthas ach 8 n-iarmhar san iomlán a bheith neamhathraitheach.Breathnaíodh na hathruithe is forleithne, lena n-áirítear scriosadh agus cuir isteach, sna timthriallta idir na heilimintí struchtúir tánaisteacha de nsp9, mar a chinn staidéir struchtúracha roimhe seo (26 ??28).Fuarthas cúig iarmhar athróg sa snáithe β agus α helix den chuid C-críochfort de nsp9.Is ionann trí iarmhar athróg agus móitíf NNE an chríochfoirt N de nsp9.Tá sé le fios gurb é an dara Asn den mhóitíf seo an t-aon iarmhar athraitheach, atá roinnte freisin ag an nsp9 hipitéiseach den choróinvíreas frog a bhaineann i bhfad i gcéin, agus a sheasann don speiceas Micrihyla letovirus 1 san fhotheaghlach Letovirinae de Alphaletovirus.Is féidir caomhnú na n-iarmhar in eilimintí struchtúir tánaisteacha nsp9 a chuíchóiriú trí chúinsí struchtúracha chun fillte nó airíonna ceangailteacha RNA aitheanta a chothabháil.Mar sin féin, ní cosúil go mbaineann an réasúnaíocht seo le caomhnú NNE, agus roimh an staidéar seo, bhí nádúr na srianta a chuireann srian le héagsúlacht na seicheamh tripeptide doiléir go hiomlán.
Chun an tábhacht a bhaineann le caomhnú nsp9-NMPylation agus NNE i macasamhlú an choróinvíris a chinneadh, rinneamar mutants HCoV-229E, a iompraíonn ionadú aonair nó dúbailte d’iarmhair críochfoirt nsp9 N, rud a thugann le fios go bhfuil nsp9 NMPylation díobhálach in vitro.Sula dtosaímid, déanaimid iarracht an cheist a fhreagairt an bhfuil tionchar ag na hionadaithe seo (in aice le suíomh scoilteachta nsp8|9) ar phróiseáil phróitilíoch an réigiúin C-críochfort pp1a.Táirgeadh sraith de thógálacha polapróitéin nsp7-11 ina raibh ionadú comhfhreagracha ag an gcríochfort N de nsp9 in E. coli agus gearradh iad le Mpro athchuingreach.Níl aon tionchar suntasach ar scoilteacht próitéalaíoch na gceithre shuíomh (lena n-áirítear suíomh cliathánach nsp9) ag aon ionadú a tugadh isteach (Aguisín IR, Fíor S9), gan athruithe struchtúracha sna próitéiní seo a chuireann isteach ar scoilteacht Mpro-mediated nsp8|9 (Nó eile) a áireamh. láithreán gréasáin.
Aistríodh cealla Huh-7 le RNA fad genome HCoV-229E, ag ionchódú ionaid Ala nó Ser sna tripeiptíde NNE caomhnaithe (N3825, N3826, agus E3827) ag críochfort nsp9 N, rud a léiríonn go bhfuil an chuid is mó de na sócháin marfach.Bhíomar in ann an víreas a tharrtháil tríd an Ser nó Ala den N-terminal Asn (N2835A nó N2835S) a athsholáthar, ach theip orainn an víreas a aisghabháil le sócháin aonair agus dúbailte eile sa seicheamh NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (Fíor 5D).
Léiríonn na torthaí seo go bhfuil srian ar mhacasamhlú coróinvíreas i gcultúr fíocháin (mar an gcéanna nó comhchosúil), a chuireann srian le sóchán nádúrtha láithreáin NMPylation nsp9 sa chorp, agus ag tacú le príomhról na freagartha seo i saolré an choróinvíris.
Sa tsraith dheireanach de thurgnaimh, rinneamar C-críochfort His6 lipéadaithe SARS-CoV-2 nsp12 agus nsp9, agus dhá fhoirm mutant de nsp12 in E. coli.Ba iad na hiarmhair láithreáin ghníomhacha sna fearainn NiRAN agus RdRp faoi seach Úsáid Ala ina ionad (Fíor 6A agus aguisín SI, Tábla S2).Freagraíonn K4465 in SARS-CoV-2 nsp12 do K4135 in HCoV-229E (Foscríbhinn IR, Fíor S2), a cruthaíodh a bheith riachtanach do ghníomhaíocht NiRAN agus macasamhlú HCoV-229E (Fíor 3D agus E).Freagraíonn an t-iarmhar seo freisin don iarmhar víreas artaireach EAV nsp9 K94, a taispeánadh roimhe seo a bheith riachtanach le haghaidh féin-UMPylation/féin-GMPylation NiRAN (16).Mar a thaispeántar i bhFíor 6B, tá gníomhaíocht UMP transferase ag SARS-CoV-2 nsp12 ag baint úsáide as nsp9 mar shubstráit, agus tá an tsóiteáin suíomh gníomhach nsp12_K4465A neamhghníomhach.Ní dhéanann an t-ionadú dúbailte i seicheamh saintréith SDD de mhóitíf RdRp C difear do ghníomhaíocht UMP transferase (Fíor 6B), rud a léiríonn nach bhfuil aon éifeacht dhíreach ag gníomhaíocht RdRp i nsp9 UMPylation.Fuarthas sonraí cosúla ag baint úsáide as CTP, GTP agus ATP (aguisín IR, Fíor S10).Go hachomair, tugann na sonraí seo le fios go bhfuil gníomhaíocht choimeádach ag NMPylation nsp9 arna idirghabháil ag NiRAN i gcoróinvíris a ionadaíonn gineacha éagsúla den fhotheaghlach orthocoronavirus.
SARS-CoV-2 nsp12-idirghabhála NMPylation nsp9.(A) Glóthach SDS-polyacrylamide dhaite le Coomassie a thaispeánann an próitéin athchuingreach a úsáidtear sa tástáil NMPylation.Mar rialú, baineadh úsáid as próitéin mutant le hionadú suímh ghníomhach i bhfearann NiRAN (K4465A) agus RdRp (DD5152/3AA) de SARS-CoV-2 nsp12.Tá uimhriú na n-iarmhar bunaithe ar shuíomh i pp1ab.(B) Autoradiograph de bhrath UMPylation ag baint úsáide as nsp9-His6 agus [α-32P]UTP mar an tsubstráit de nsp12-His6 (cineál fiáin [wt] agus mutant).Taispeántar mais mhóilíneach (i gcilealtáin) den phróitéin lipéadaithe ar chlé.
Is iondúil go gcaomhnaítear fearainn NiRAN i Nidovirales (16), rud a thugann le fios go gcatalaíonn siad imoibrithe einsímeacha atá riachtanach le haghaidh macasamhlú Nidovirus.Sa staidéar seo, bhíomar in ann a chruthú go n-aistríonn fearann NiRAN den choróinvíreas NMP (a ghintear ó NTP) go nsp9, próitéin mistéireach ceangailteach RNA a bhaineann le macasamhlú víreas (26 ?? 29 ), chun é a chinneadh mar sprioc nádúrtha agus comhpháirtí de coronavirus RTC.
Roinneann an bhfearann NiRAN trí mhóitíf seicheamh (AN, BN, agus CN), ina bhfuil líon an-bheag iarmhar a chaomhnaítear i ngach teaghlach san ord Nidovirales monophyletic ach an-difreáilte (8, 16).Tá sé léirithe ag staidéir le déanaí go bhfuil baint acu ó thaobh struchtúir de le teaghlach de phróitéiní cosúil le kinase próitéine nach bhfuil tréithe den chuid is mó, ar a dtugtar an teaghlach SelO ar dtús (17, 19, 22, 30, 31).Tá fillteáin kinase ag próitéiní a bhaineann le SelO, ach níl roinnt iarmhair láithreán gníomhach caomhnaithe in easnamh i kinases clasaiceach (22, 32).Bunaithe ar an treoshuíomh droim ar ais na móilíní ATP faoi cheangal go dtí an suíomh gníomhach agus cobhsaithe ag idirghníomhaíochtaí sonracha, SelO bhí hipitéiseach agus ina dhiaidh sin deimhníodh a aistriú AMP (in ionad fosfáit) chuig an tsubstráit próitéine (22), cé go bhfuil próitéin baictéarach SelO-mhaith YdiU eile. Taispeánadh le déanaí go bhfuil sé mar chatalaíoch ar an gceangal comhfhiúsach de UMP le Tyr agus a iarmhair foshraitheanna próitéine éagsúla (33).
D’fhonn tuar na n-iarmhar láithreán gníomhach toimhdeach den fhearann coronavirus NiRAN a dhearbhú agus a leathnú, d’úsáideamar modhanna bithcheimiceacha agus géiniteacha droim ar ais chun anailís sóchán a dhéanamh ar an coronavirus nsp12 (Fíor 3D agus E agus aguisín SI, Fíor S3 agus tábla) S1â S4).Léiríonn na sonraí go gcuireann athsholáthar HCoV-229E K4135, R4178 agus D4280 le Ala deireadh le gníomhaíocht transferase in vitro NMP agus macasamhlú víreas i gcultúr cille (Fíor 3D agus aguisíní E agus SI, Fíor S3), ag tacú lena láithreacht i NTP γ-fosfáit. (K4135, R4178) agus comhordú na n-ian miotail suímh ghníomhacha (D4280).Léiríodh go gcuirfí deireadh le macasamhlú víreasach le hionadú E4145A an Glu caomhnaithe i raon víreas nead na n-éan a thuar go ndéanfaí an seasamh K4135 (17) a chobhsú, ach is ionadh é, coinníodh an ghníomhaíocht sa mheasúnacht in vitro NMPylation (Fíor 3D agus E agus aguisín SI, Fíor S3 agus Táblaí S1–S4).Breathnaíodh den chineál céanna nuair a tugadh isteach an t-ionadú comhfhreagrach in homolog YdiU de Salmonella typhimurium (E130A) (33).Le chéile, tacaíonn na sonraí seo le feidhm rialála an iarmhair chaomhnaithe seo seachas leis an bhfeidhm chatalaíoch.
Tháinig laghdú ar ghníomhaíocht NMPylation in vitro agus laghdú suntasach ar mhacasamhlú víreas i gcultúr na gceall de thoradh athchur an iarmhair Phe caomhnaithe (F4281A) laistigh den raon nestovirus san fhearann HCoV-229E NiRAN (8) agus laghdú suntasach ar mhacasamhlú víreas i gcultúr na gceall (Fíor 3D, E agus SI). aguisín, Fíor S3).Tá na sonraí comhsheasmhach le feidhm rialála thábhachtach an iarmhair seo, amhail an móitíf homalógach DFG Phe iarmhar a taispeánadh roimhe seo.I kinases próitéin clasaiceach, tá sé mar chuid den lúb ceangailteach Mg2+ agus cabhraíonn sé leis an spine a chóimeáil agus a rialáil???Ag teastáil le haghaidh gníomhaíocht chatalaíoch éifeachtach (32, 34).Chuir Ala agus Arg in ionad iarmhair K4116 (sa mhóitíf preAN), faoi seach, deireadh le macasamhlú víreasach agus, mar a bhíothas ag súil leis, bhí éifeachtaí éagsúla aige ar ghníomhaíocht NMP transferase in vitro, ag brath ar an slabhra taobh aimínaigéad a tugadh isteach (Fíor 3D Agus E agus aguisíní SI). , Fíor S3).Tá na sonraí feidhmiúla comhsheasmhach leis an bhfaisnéis struchtúrach, rud a léiríonn go bhfuil idirghníomhaíocht bunaithe ag an iarmhar seo le fosfáit ATP (17).I bhfearann NiRAN i dteaghlaigh víreas neadaithe eile, tá suíomh HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 áitithe ag Lys, Arg nó His (8), rud a thugann le fios go bhfuil srian feidhmiúil an iarmhair shonraigh seo maolaithe.Cuireann ionadú D4188A agus D4283A deireadh le nó laghdaítear go láidir gníomhaíocht einsímí agus cuireann sé deireadh le macasamhlú víreas (Fíor 3).Caomhnaítear an dá iarmhar seo sa chuid is mó (ach ní i ngach ceann) víris neadaithe (8), rud a léiríonn feidhm thábhachtach a bhaineann go sonrach le teaghlaigh ach b’fhéidir nach mbaineann le catalaíoch.Baineadh úsáid as ionadú Ala ó roinnt iarmhair Lys agus Asp eile (K4113A, D4180A, D4197A agus D4273A) nach bhfuil caomhnaithe sa Coronaviridae nó teaghlaigh Nestioviridae eile (8) mar rialuithe.Mar a bheifí ag súil leis, is féidir glacadh leis na hionadaigh sin den chuid is mó, le laghdú beag ar ghníomhaíocht einsímí agus ar mhacasamhlú víreasach i gcásanna áirithe (Fíor 3 agus aguisín SI, Fíor S3).Tríd is tríd, tá na sonraí mutagenesis coronavirus an-chomhsheasmhach le sonraí féin-GMP agus géineolaíocht droim ar ais de EAV NiRAN-RdRp (16), ina bhfuil feidhmeanna tábhachtacha iarmhar EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) K94 (a fhreagraíonn do HCoV-229E K4135), R124 (a fhreagraíonn do R4178), D132 (a fhreagraíonn do D4188), D165 (a fhreagraíonn do D4280), F166 (a fhreagraíonn do F4281).Ina theannta sin, tá sonraí mutagenesis HCoV-229E comhsheasmhach agus leathnaithe ó na sonraí géiniteacha droim ar ais SARS-CoV a tuairiscíodh roimhe seo (16), díreach chomh han-chosúil leo siúd a breathnaíodh don mhóitíf CN comhfhreagrach Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 The. feinitíopa a thuairiscítear -F219A agus HCoV-229E_F4281A (Fíor 3 D agus E agus aguisín SI, Fíor S3 agus Tábla S1-S4).
I gcomparáid le orthologs EAV (16), a bhfuil tosaíocht shoiléir acu do UTP agus GTP (san imoibriú féin-NMPylation), léiríonn ár staidéar gur féidir leis an bhfearann coronavirus NiRAN (arna ionadú ag HCoV-229E agus SARS-CoV-2) a bheith éifeachtach. aistrithe Na ceithre NMP go léir, cé gur rogha bheag é UMP (Fíoracha 1 agus 3).Tá sainiúlacht réasúnta íseal an chomhfhoshraith NTP sonrach comhsheasmhach leis an struchtúr sár-chomhchodach SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 a tuairiscíodh le déanaí, ina gceanglaíonn ADP-Mg2+ le suíomh gníomhach NiRAN, ach ní le Cuid adenine. de fhoirmiú idirghníomhaíochtaí sonracha (17).In ár staidéar, níl aon éifeacht dhifreálach ag an gcineál nucleotide a úsáidtear san imoibriú NMPylation ar ghníomhaíocht an phróitéin mutant (Aguisín IR, Fíor S3), rud a léiríonn nach bhfuil aon cheann de na hiarmhair seo gaolmhar go dlúth le ceangailteach nucleobase ar leith.Tá staidéar fós le déanamh ar an mbonn struchtúrach agus ar an tábhacht bhitheolaíoch a d’fhéadfadh a bheith ag na roghanna comhfhoshraitheanna NTP éagsúla a breathnaíodh i bhfearainn NiRAN de choróinvíris agus víreas artaireach;féadfaidh siad a bheith fíor nó féadfaidh siad a bheith mar gheall ar theorainneacha a staidéir faoi seach.Faoi láthair, ní féidir a chur as an áireamh go bhfuil tosaíocht chomhfhoshraith éagsúil ag gníomhaíocht NMPylator ionchasach an fhearainn víreas artaireach NiRAN (i gcomparáid leis an ngníomhaíocht féin-NMPylation ar shaintréithe roimhe seo), ag cur san áireamh an chosúlacht idir an artaireach agus an coronavirus. Tá fearann NiRAN ag a theorainn.Déan comparáid idir seicheamh-bhunaithe (16).I gcomparáid leis an pseudokinase SelO, a úsáideann Mg2+ mar chomhfhachtóir, tá gníomhaíocht an choróinvíris agus víreas artaireach NiRAN ag brath ar Mn2+ (16) (Fíor 3C agus aguisín SI, Fíor S1).Is gné neamhghnách de NMPylators próitéine é an spleáchas Mn2+ agus tosaíocht shoiléir do UTP, agus níor deimhníodh ach le déanaí sa phróitéin YdiU de Salmonella typhimurium, a chatalaíonn UMPylation chaperone dian próitéin Mn2+-spleách chun cealla a chosaint ó ionduchtú strus Linn snámha ATP cille ( 33).
Soláthraíonn an chosúlacht struchtúrach a ndearnadh cur síos air le déanaí idir fearann coronavirus NiRAN agus kinases próitéin cheallacha (17, 19) tacaíocht bhreise do chumas NiRAN NMP a nascadh go comhfhiúsach le próitéiní eile a thuairiscigh muid sa staidéar seo.Dhírigh muid ár gcuardach le haghaidh spriocanna féideartha NiRAN ar na próitéiní atá ionchódaithe ag HCoV-229E ORF1a, arb eol go gcuidíonn siad go díreach nó go hindíreach le macasamhail ORF1b-ionchódaithe RTC (12, 35).Soláthraíonn ár dturgnaimh fianaise dhochloíte maidir le NMPylation éifeachtach agus sonrach nsp9 (Fíor 2).Má úsáidtear an spriocphróitéin i mbarrachas molar atá 8 go 10 n-uaire níos airde ná sin na heinsíme (nsp12), deimhnítear go bhfuil nsp9 iomlán (mono)NMPized (Fíor 4).Thángamar ar an gconclúid go bhfuil an t-idirghníomhú idir nsp12 agus nsp9 gearrthéarmach agus nach mbeidh sé ina choimpléasc cobhsaí le nsp9 (in éagmais fo-aonaid RTC eile).Tá an chonclúid seo tacaithe ag staidéir idirghníomhaíochta próitéine ar an proteome SARS-CoV (35).D'aithin anailís MS an t-aimín príomhúil d'iarmhar N-críochfort nsp9 mar shuíomh NMPylation (aguisín IR, Fíor S5).Déanann foirmiú an bhanna phosphoramidate agus an grúpa aimín N-críochfort idirdhealú idir gníomhaíocht NMPylation NiRAN-idirghabhála ó imoibriú AMPylation Pseudomonas syringae SelO-mediated AMPylation, a chatalaíonn foirmiú AMP O-nasctha ag Ser, Thr, nó iarmhair Tyr aduchtán peptide ( 22), agus S. typhimurium YdiU foirmeacha O-nasctha (le Tyr) agus N-nasctha (lena) peptide-UMP adducts.Léiríonn an t-eolas teoranta atá ar fáil ar theaghlach próitéiní SelO go bhfuil difríocht mhór ag baill den teaghlach mór próitéine seo maidir le foirmiú adducts peptide-NMP.Breathnú suimiúil é seo ar fiú tuilleadh staidéir a dhéanamh air.
Thug na sonraí a fuarthas sa staidéar seo dúinn hipitéis a thabhairt go dteastaíonn NMPylation nsp9 saor in aisce.I gcomhthéacs macasamhlú víreasach, cuirfear é seo ar fáil trí scoilteacht próitéalaíoch an láithreáin phróiseála nsp8|nsp9 sa mhacasamhail polapróitéin pp1a arna idirghabháil ag Mpro agus pp1ab.I bhformhór na gcoróinvíreas, is é Asn an difríocht idir an suíomh sonrach seo (VKLQ | NNEI in HCoV-229E) agus gach suíomh scoilteachta Mpro coronavirus eile (seachas iarmhar beag eile, mar Ala, Ser Or Gly) áitiú P1â???Suíomh (36).Léirigh na sonraí scoilteachta peptide a fuarthas sna staidéir luatha go raibh éifeachtacht scoilteachta an tsuímh nsp8|nsp9 níos ísle ná mar a bhí ag suíomhanna eile, rud a thugann le fios go bhféadfadh 1) ról rialála a bheith ag an láithreán sonrach seo i bpróiseáil chomhordaithe tráthúil an chríochfoirt C. pp1a réigiún, nó 2) a Ról an speisialta caomhnaithe nsp9 N-críochfort i macasamhlú víreas (37).Thaispeáin ár sonraí (Fíor 5A) go raibh an fhoirm athchuingreach de nsp9 a iompraíonn an t-seicheamh N-críochfort fíor NMPized go héifeachtach ag nsp12.Baineadh an t-ord cliathánach N-críochfort ag fachtóir Xa (nsp9-His6; aguisín SI, Tábla S1) nó scoilteacht Mpro-mediated (nsp7-11-His6; Fíor 5A agus aguisín SI, Tábla S1).Go tábhachtach, léirigh an réamhtheachtaí neamhghearrtha nsp9-ina bhfuil nsp7-11-His6 friotaíocht le NMPylation de nsp12, atá comhsheasmhach lenár sonraí, rud a léiríonn go bhfuil an adduct nsp9-NMP déanta tríd an amine bunscoile N-críochfort (aguisín SI, Fíor S5) .Chun tuiscint níos doimhne a fháil ar shainiúlacht an tsubstráit NiRAN, dhíríomar ansin ar na hiarmhair N-críochfort in aice láimhe de nsp9.In éagmais próitéiní eile, tá siad solúbtha ó thaobh struchtúir de, rud a chuireann cosc orthu a bheith faoi deara i bhfoirm neamhlipéadaithe nsp9 (26 28, 38), rud a léiríonn a n-éagsúlacht nádúrtha teoranta. feidhm na blúire N-críochfort nsp9.Léiríonn ionaid Ala d’iarmhair chaomhnaithe sa réigiún seo (Fíoracha 5C agus D agus aguisín SI, Fíor S8) go bhfuil N3826 riachtanach do NMPylation in vitro nsp9, cé go dtagann laghdú ar NMPylation in ionad N3825A agus E3827A, agus nach bhfuil ionadú M3829A agus P3830A mar thoradh air. .Is léir go mbeidh tionchar aige ar nsp9 NMPylation.Cé nach bhfuil ach éifeacht measartha ag ionadú N-críochfort Asn (N3825A, N3825S) ar nsp9 NMPylation agus macasamhlú víreas i gcultúr cille (Fíor 5C agus D), scriosadh seicheamh iarmhair Asn ón dipeptide N-críochfort 3825-NN Cruthaíodh go bhfuil sé marfach do víris, rud a thugann le fios go bhfuil gá le hiarmhar Asn amháin roimh iarmhar eile ag an gcríochfort N, b'fhearr Asn, cé gur cosúil gur féidir glacadh le hionadú iarmhair dá samhail (Fíor 5B, C, agus D).Bainimid de thátal as go gcinntíonn an dé-peptide 3825-NN, go háirithe an t-iarmhar N3826 caomhnaithe agus riachtanach laistigh den raon coronavirus (aguisín IR, Fíor S6), ceangal agus treoshuíomh ceart an nsp9 N-críochfort i suíomh gníomhach NiRAN.
Nuair a chuirtear Ala (E3827A) in ionad Glu caomhnaithe na bhfotheaghlach go léir, coinnítear nsp9 NMPylation in vitro ach tá sé marfach do víris i gcultúr cille (Fíor 5C agus D), rud a léiríonn feidhm bhreise an iarmhair seo, mar shampla, i bpríomh-idirghníomhaíochtaí (NMPylated nó neamhathraithe ) nsp9 N-téarma agus fachtóirí eile a bhfuil baint acu le macasamhlú víris.Níor chuir sócháin Nsp9 isteach ar phróiseas próitéalaíocha nsp9 ná ar aon nsps cóngarach (39) (Aguisín IR, Fíor S9), rud a thugann le fios nár tharla feinitíopaí marfacha roinnt sócháin nsp9 a breathnaíodh de bharr dírialú an limistéir phróisis-críochfort próitilíocha C pp1a. .
Soláthraíonn na sonraí thuas fianaise gur féidir le críochfort N nsp9 a UMPylated (nó a mhodhnú go páirteach le NMP eile) tar éis cóireáil Mpro-mheánaithe ar an suíomh scoilteachta nsp8|9 in pp1a/pp1ab.Ina theannta sin, mar gheall ar chaomhnú sármhaith an chríochfoirt N nsp9 (lena n-áirítear na hiarmhair uathúla agus athróg Asn sa teaghlach coronavirus) agus na sonraí géineolaíochta droim ar ais a fuarthas sa staidéar seo (Fíoracha 3E agus 5D) tháinig muid ar an tátal go raibh an cur síos ar nsp9 NMPylation atá gaolmhar ó thaobh na bitheolaíochta de agus riachtanach le haghaidh macasamhlú an choróinvíris.Tá iarmhairtí feidhme an mhodhnaithe seo fós le staidéar a dhéanamh, mar shampla, maidir leis an ngníomhaíocht cheangailteach RNA nsp9 (neamh-shonrach) a thuairiscítear roimhe seo (foirm neamhmhodhnaithe) (2628).Féadfaidh NMPylation N-críochfort difear a dhéanamh freisin ar idirghníomhaíocht nsp9 le foshraitheanna próitéine nó RNA nó ar fhoirmiú tionóil éagsúla ceithre leibhéal.Breathnaíodh iad seo i staidéir struchtúracha agus deimhníodh go mbaineann siad go feidhmiúil le macasamhlú an choróinvíris, cé go háirithe in éagmais an mhodhnaithe seo (26- ââ29, 40).
Cé go bhfuil gá fós le sainiúlacht sprice an fhearainn coronavirus NiRAN a shainiú níos mionsonraithe, léiríonn ár gcuid sonraí go bhfuil sainiúlacht sprice próitéine an fhearainn coronavirus NiRAN an-chúng.Cé go dtacaíonn caomhnú na n-iarmhair láithreáin gníomhacha tábhachtacha (8, 16) i bhfearann NiRAN de gach teaghlach nidovirus go láidir le gníomhaíocht an NMPylator caomhnaithe na próitéiní seo, tá céannacht iarmhair phóca ceangailteach an tsubstráit den fhearann seo Caomhnú agus caomhnú fós le bheith tréithrithe. , agus féadfaidh sé a bheith éagsúil idir teaghlaigh éagsúla cuspóirí Nidovirales.Mar an gcéanna, tá spriocanna ábhartha víreas neadaithe eile fós le cinneadh.Féadfaidh siad a bheith ina orthologs iargúlta nsp9 nó próitéiní eile, toisc go bhfuil na sraitheanna lasmuigh de na cúig réimse macasamhail a chaomhnaítear go ginearálta i víris neadaithe níos lú caomhnaithe (8), lena n-áirítear an t-eagar genome idir Mpro agus NiRAN, Ina measc, tá nsp9 suite sa coróinvíreas.
Ina theannta sin, ní féidir linn a chur as an áireamh faoi láthair go bhfuil spriocanna breise (lena n-áirítear ceallach) ag fearann NiRAN.Sa chás seo, is fiú a lua gur cosúil go bhfuil “máistir-rialaitheoirí” ag na homalóga baictéaracha sa NMPylators próitéin seo atá ag teacht chun cinn (NMPylators) (30, 31)?Déanann NMP éagsúlacht de phróitéiní ceallacha a mhodhnú chun a ngníomhaíochtaí iartheachtacha a rialáil nó a dhíchur, agus ar an gcaoi sin ról a imirt i bpróisis éagsúla bitheolaíocha, mar fhreagra ar strus cheallacha agus homeostasis redox (22, 33).
Sa staidéar seo (Fíoracha 2 agus 4 agus Aguisín SI, Fíoracha S3 agus S5), bhíomar in ann a chruthú gur aistrigh nsp12 an chuid UMP (NMP) go dtí suíomh amháin (caomhnaithe) in nsp9, agus níor athraíodh próitéiní eile sa a úsáidtear Faoi na coinníollacha, tacaítear le sainiúlacht tsubstráit dea-shainithe (seachas scaoilte).Ag teacht leis seo, i gcomparáid le N-críochfort nsp9 NMPylation, tá gníomhaíocht NMPylation nsp12 féin an-íseal, éilíonn a bhrath níos faide ama nochta uathradagrafaíochta, agus úsáidtear méadú 10-huaire ar thiúchan nsp12.Ina theannta sin, theip ar ár n-anailís MS fianaise a sholáthar do NMPylation de nsp12, rud a thugann le tuiscint gur gníomhaíocht thánaisteach (ar a fearr) féin-NMPylation fearainn NiRAN.Mar sin féin, ba chóir a thabhairt faoi deara go bhfuil staidéir eile curtha ar fáil réamhfhianaise go bhféadfaidh an stádas féin-AMPylation de NMPylator baictéarach rialú a dhéanamh ar a ngníomhaíocht NMPylation ar fhoshraitheanna próitéine eile (22, 33).Mar sin, tá gá le tuilleadh taighde chun imscrúdú a dhéanamh ar na héifeachtaí feidhmiúla a d’fhéadfadh a bheith ag gníomhaíochtaí féin-NMPylation arna dtuairisciú do EAV nsp9 (16) agus don choróinvíreas nsp12 (an staidéar seo), lena n-áirítear an éifeacht atá beartaithe mar chaperone ar fhilleadh an fhearainn C-críochfort RdRp ( 16) ).
Roimhe seo, breithníodh roinnt hipitéisí maidir le feidhmeanna iartheachtacha féideartha an fhearainn nidoviral NiRAN, lena n-áirítear RNA ligase, RNA-capped guanylate transferase agus gníomhaíocht priming próitéin (16), ach níl aon cheann acu ag luí leis na feidhmeanna iartheachtach atá ar fáil.Tá an fhaisnéis a fhaightear sna seasaimh seo a leanas díreach mar an gcéanna gan toimhdí breise a dhéanamh.Is iad na sonraí a fuarthas sa staidéar seo is comhsheasmhaí le (ach ní féidir a chruthú) go bhfuil baint ag fearann NiRAN le sintéis RNA de bharr próitéine a thionscnamh.Creideadh roimhe seo go bhfuil feidhm an fhearainn NiRAN i 5 ??Níl aon tionchar acu seo agus ag Tacú le sonraí eile ar theorannú ²-RNA nó ar imoibrithe ligation RNA.Mar sin, mar shampla, meastar go mbaineann suíomh gníomhach NiRAN leis an Asp caomhnaithe mar bhonn ginearálta (D252 i Pseudomonas syringae SelO; D4271 in HCoV-229E pp1ab; D208 i SARS-CoV-2 nsp12) (IR Aguisín , figiúr 2 ).S2) (17, 22, 33), cé go ndéanann an einsím comhfhiúsach-(lysyl-N)-NMP idirmheánach an einsím comhfhiúsach-(lysyl-N)-NMP idirmheánach an catalysis san ligáis RNA-spleách ATP agus einsím caipínithe RNA, a bhfuil baint aige le hiarmhar Lys neamh-Athraithe ( 41).Ina theannta sin, cuireann sainiúlacht iontach seicheamh-bhunaithe an coronavirus NiRAN do spriocanna próitéine caomhnaithe agus an tsainiúlacht réchúiseach do chomhfhoshraitheanna NTP (is fearr le UTP) i gcoinne einsím caipínithe trí mheán NiRAN nó feidhmeanna cosúil le ligáis RNA.
Ar ndóigh, tá go leor oibre breise ag teastáil chun ról féideartha nsp9-UMP (nsp9-NMP) i sintéis RNA spreagtha próitéine a fhíorú agus, má tá sé cruthaithe, a nascfaidh roinnt tuarascálacha suimiúla ach (go dtí seo) a tuairiscíodh roimhe seo. .Breathnuithe iargúlta.Mar shampla, socraíodh go dtosaíonn deireadh an RNA diúltach-snáithe den choróinvíreas le snáithe oligo(U) (42, 43).Tá an bhreathnóireacht seo ag teacht leis an smaoineamh go gcuirtear tús le sintéis RNA snáithe diúltach tríd an bhfoirm UMPylated de nsp9 a cheangal leis an eireaball polai(A) (truiceoirí), a d'fhéadfadh a bheith curtha chun cinn trína cheangal RNA An ghníomhaíocht agus/nó an idirghníomhú leis. próitéin RTC eile.Is féidir an chuid UMP a sholáthraíonn nsp9 a úsáid ansin mar “primer” le haghaidh oligouridylation trí mheán nsp7/8/nsp12, ag baint úsáide as an eireaball 3??²-polai(A) sa RNA genomic nó seicheamh oligo eile (A) ina bhfuil. feidhmíonn sé mar theimpléad, cosúil leis an meicníocht a bunaíodh le haghaidh an próitéin VPg picornavirus (44).Cad a tharlaíonn má tá an togra “neamhnormatach”????Soláthraíonn tionscnamh na sintéise RNA diúltach-snáithe (spreagtha próitéine) nasc leis na breathnuithe, rud a léiríonn go bhfuil UMP (in ionad UTP) ag an RNA snáithe diúltach coronavirus ag a deireadh (42), a mheastar a thugann le fios go bhfuil an Aigéad núicléach Scoilteann Dicer an foirceann fosfarlaithe ag endonuclease anaithnid a bhaineann go sonrach le fualán.Má dheimhnítear é, is féidir leis an ngníomhaíocht hidrealaíoch aigéid núicléigh seo cabhrú leis an bhfoirm UMPylated oligomeric de nsp9 a scaoileadh ó dheireadh 5 ² an tsnáithe diúltach nascent.Tá ról féideartha nsp9 i priming próitéine comhsheasmhach freisin le staidéir ghéiniteach droim ar ais roimhe seo, a léirigh go n-idirghníomhaíonn nsp9 (agus nsp8) go criticiúil agus go sonrach leis an eilimint RNA cis-ghníomhaithe caomhnaithe in aice le deireadh 3 den genome coronavirus.45).De réir na tuarascála seo, is féidir na breathnuithe roimhe seo a athscrúdú agus a leathnú trí thaighde breise a dhéanamh.
Go hachomair, chinn ár sonraí an ghníomhaíocht shonrach a bhaineann le clib einsíme víreas neadaithe dílsithe atá nasctha le RdRp ag an gcríochfort N.Sa choróinvíreas, úsáidtear an ghníomhaíocht UMPylator/NMPylator nua-aimsithe seo atá nua-aimsithe ag NiRAN chun brath ar Mn2+ agus iarmhair Asn cóngarach agus cruthaítear bannaí fosfaramidáit (ísealfhuinnimh) leis an bpríomhaimín N-críochfort.Trí scoilteacht Mpro-mediated ag an suíomh scoilteachta nsp8|9, is féidir an sprioc nsp9 a úsáid le haghaidh NMPylation, rud a léiríonn an cúpláil feidhme idir an protease agus fearann NiRAN, a shíneann go RdRp.Soláthraíonn caomhnú na n-iarmhar lárnach i suíomh gníomhach nsp12 NiRAN agus an sprioc nsp9, in éineacht le sonraí a fuarthas ó dhá choróinvíreas lena n-áirítear SARS-CoV-2, fianaise láidir gur coróinvíreas é nsp9 NMPylation Is príomhchéim i macasamhlú víris iad gnéithe coimeádacha freisin.Tugann na sonraí atá ar fáil dúinn a thabhairt ar an tátal gur cás réasúnta é an ról sonrach atá ag foirm NMPylated de nsp9 i sintéis RNA spreagtha próitéine don choróinvíreas agus víris neadaithe eile, agus féadfaidh NiRAN díriú ar phróitéiní neamhaitheanta eile freisin.An víreas a rialáil.Idirghníomhaíocht óstach.Má dheimhnítear é, méadóidh rannpháirtíocht primers próitéine i sintéis víreasach RNA cleamhnas seicheamh na bhfearann Mpro/3CLpro agus RdRp idir an sárghrúpa a braitheadh roimhe seo agus cosúil le picornavirus (9), atá aontaithe anois sna Pisonivirites a bunaíodh le déanaí (9). 46) sa chatagóir.
Léiríonn ár sonraí freisin gur féidir na gníomhaíochtaí bunúsacha, roghnaíoch agus coimeádach einsíme a aithníodh sa staidéar seo a úsáid mar spriocanna do dhrugaí frithvíreasacha.Is féidir comhdhúile a chuireann isteach ar cheangal (agus modhnú ina dhiaidh sin) ar an bhfoirceann caomhnaithe nsp9 N ar shuíomh gníomhach NiRAN a fhorbairt ina ndrugaí frithvíreasacha éifeachtacha agus ilúsáideacha, atá oiriúnach chun cóireáil a dhéanamh ar choróinvíreas ainmhithe agus daonna ó (fo)ghéineas Ionfhabhtuithe éagsúla. , lena n-áirítear SARS-CoV-2 agus Coronavirus Siondróm Riospráide an Mheán-Oirthir.
Méadaíodh seicheamh códaithe na próitéine coróinvíreas a tháirgtear sa staidéar seo ag RT-PCR ag baint úsáide as RNA scoite ó Huh-7 atá ionfhabhtaithe le HCoV-229E nó Vero E6 ionfhabhtaithe le SARS-CoV-2, agus cuireadh isteach é ag baint úsáide as nósanna imeachta caighdeánacha clónála.pMAL-c2 (Saotharlann Bhitheolaíoch Shasana Nua) nó veicteoir slonn pASK3-Ub-CHis6 (47) (Foscríbhinn IR, Táblaí S1 agus S2).Tugadh isteach ionadaí códón aonair ag mutagenesis suíomh-bhunaithe PCR-bhunaithe (48).Chun an próitéin chomhleá MBP a tháirgeadh, rinneadh cealla E. coli TB1 a chlaochlú leis an tógáil plasmid pMAL-c2 cuí (aguisín IR, Tábla S1).Rinneadh an próitéin chomhleá a íonú le crómatagrafaíocht cleamhnais amalóis agus scoilte le fachtóir Xa.Ina dhiaidh sin, íonaíodh an próitéin C-críochfort His6-clibeáilte ag crómatagrafaíocht chleamhnas miotail Ni-díluailithe (Ni-IMAC) mar a thuairiscítear roimhe seo (49).Chun an próitéin comhleá ubiquitin a tháirgeadh, d'úsáid cealla E. coli TB1 an tógáil plasmid cuí paASK3-Ub-CHis6 (Aguisín IR, Táblaí S1 agus S2) agus ionchódú DNA plasmid pCGI ubiquitin-sonrach C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Claochlú (47).Glanadh an próitéin coronavirus clibeáilte His6 C-críochfort mar a thuairiscítear roimhe seo (50).
Rinneadh an tástáil féin-NMPylation de HCoV-229E nsp12-His6 mar a thuairiscítear in EAV nsp9 (16).I mbeagán focal, tá nsp12-His6 (0.5 µM) 50 mM 4-(2-hiodrocsaitil)-1-piperazineethanesulfónaigéad (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiotreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µMate meaitseálann an NTP sonraithe agus 0.17 µM [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) ag 30 °C ar feadh 30 nóiméad.I ngach measúnacht NMPylation (caighdeánach) eile de NMPylation nsp12-mediated nsp9, déantar na coinníollacha imoibrithe a choigeartú mar seo a leanas: nsp12-His6 (0.05 µM) agus nsp9-His6 (4 µM) i láthair 50 mM HEPES-KOH (pH 8. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM léirithe NTP, agus 0.17 µM meaitseáilte [α32-P]NTP.Tar éis gortha ar feadh 10 nóiméad ag 30 ° C, meascadh an sampla imoibrithe le maolán sampla SDS-PAGE: 62.5 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% gliocról agus 0.005% bromophenol gorm.Dínádúraíodh an próitéin trí théamh ag 90 °C ar feadh 5 nóiméad agus scartha le 12% SDS-PAGE.Tá an glóthach socraithe agus dhaite le tuaslagán Coomassie Brilliant Blue (40% meatánól, 10% aigéad aicéiteach, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), dídhaite, agus nochta do scáileán íomháithe fosfair ar feadh 20 uair (chun nsp12 a bhrath ó NMPylation). nó (uasmhéid) 2 Uair (chun nsp9 NMPylation a mheasúnú).Baineadh úsáid as íomháóir Typhoon 9200 (GE Healthcare) chun an scáileán a scanadh agus úsáideadh ImageJ chun déine an chomhartha a anailísiú.
Le haghaidh anailíse MS, úsáideadh 1 µM nsp12-His6 agus 10 µM nsp9 (gan chlib heicsahistidine) in anailís NMPylation (aguisín IR, Tábla S1) agus baineadh úsáid as an tiúchan méadaithe de 500 µM UTP agus GTP.Ag brath ar a dtiúchan agus ar a gcáilíocht próitéine a rabhthas ag súil leis, úsáideadh córas HPLC Aicme H Uiscí ACQUITY feistithe le colún MassPrep (Uisce) chun 1 go 10 µL de thuaslagán próitéine maolánach a dhíshalannú ar líne.Cuirtear an próitéin díshaillte isteach i bhfoinse ian electrospray mais-speictriméadar Synapt G2Si (Uiscí) tríd an ngrádán seo a leanas de mhaolán A (uisce / 0.05% aigéad formach) agus maolán B (aicéatóintríle / 0.045% aigéad formach), agus tá an teocht colún. 60 ° C agus ráta sreafa de 0.1 mL/nim: elution go isocratach le 5% A ar feadh 2 nóiméad, ansin grádán líneach go 95% B laistigh de 8 nóiméad, agus coinnigh 95% B ar feadh 4 nóiméad eile.
Aimsítear iain dhearfacha a bhfuil raon maise acu idir 500 agus 5000 m/z.Déantar glu-fibrinopeptide B a thomhas gach 45 soicind le haghaidh ceartúchán mais-srutha.Úsáid bogearraí ionstraim MassLynx le síneadh MaxEnt1 chun an meánspeictream a dhíchóimeáil tar éis an bonnlíne agus an smúdála a asbhaint.
Rinneadh UMPylated HCoV-229E nsp9 a dhíleá trí trypsin modhnaithe de ghrád seicheamhaithe (Serva) a chur leis agus é a ghoradh thar oíche ag 37 °C.Baineadh úsáid as colún casadh Chromabond C18WP (cuid uimhir 730522; Macherey-Nagel) chun na peiptídí a dhíshalannú agus a chomhchruinniú.Ar deireadh, tuaslagadh an peptide i 25 µL uisce, ina raibh 5% acetonitrile agus 0.1% aigéad formach.
Rinne MS anailís ar na samplaí agus úsáid á baint as mais-speictriméadar Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).An córas HPLC nanoâ deiridh (Dionex), atá feistithe le deireadh-suite saincheaptha 50 cm??Colún 75 μm C18 RP pacáilte le coirníní maighnéadacha 2.4 μm (Dr. Albin Maisch Ardfheidhmíocht LC GmbH) Ceangail leis an mais-speictriméadar ar líne trí fhoinse nanaspray Proxeon;instealladh 6 µL de thuaslagán díleá trypsin isteach i dtrastomhas istigh 300 µm × ??1 cm C18 Colún réamh-tiúchan PepMap (Thermo Scientific).Ag baint úsáide as uisce/0.05% aigéad formach mar thuaslagóir, bhí an sampla gafa go huathoibríoch agus díshalannaithe ag ráta sreafa de 6 µL/nóiméad.
Baineadh úsáid as na grádáin seo a leanas d'uisce/0.05% d'aigéad formach (tuaslagóir A) agus 80% aicéatóintríle/0.045% d'aigéad formach (tuaslagóir B) chun scaradh peiptídí tripteacha a bhaint amach ag ráta sreafa 300 nL/nóim: 4% B do 5 nóiméad, ansin 30 A grádán líneach go 45% B laistigh de nóiméad, agus méadú líneach go 95% tuaslagóir B laistigh de 5 nóiméad.Ceangail an colún crómatagrafach le nana-astaróir cruach dhosmálta (Proxeon), agus spraeáil an eluent go díreach chuig ribeach téite an mais-speictriméadar ag baint úsáide as poitéinseal 2,300 V. Tá baint ag an scanadh suirbhé le réiteach 60,000 san anailíseoir mais Orbitrap. le ar a laghad trí scanadh MS/MS sonraí, eisiata go dinimiciúil ar feadh 30 soicind, ag baint úsáide as díthiomsú tar éis imbhualadh ian gaiste líneach nó díthiomsú imbhuailte fuinnimh níos airde in éineacht le brath orbitrap , Is é an taifeach ná 7,500.
Am postála: Lúnasa-03-2021